Fortschrittliches Instrument analysiert Immunzellen viel detaillierter: Technologie verspricht effektivere Therapien mit verschreibungspflichtigen Medikamenten

Fortschrittliches Instrument analysiert Immunzellen viel detaillierter: Technologie verspricht effektivere Therapien mit verschreibungspflichtigen Medikamenten
Fortschrittliches Instrument analysiert Immunzellen viel detaillierter: Technologie verspricht effektivere Therapien mit verschreibungspflichtigen Medikamenten
Anonim

Forscher der Stanford University School of Medicine haben eine Maschine, die bereits zur Messung von Verunreinigungen in Halbleitern im Einsatz ist, dazu verwendet, Immunzellen weitaus detaillierter zu analysieren, als dies bisher möglich war. Die neue Technologie ermöglicht es Wissenschaftlern, gleichzeitig Dutzende von Merkmalen auf und in Zellen zu messen, während die bestehende Technologie typischerweise bei etwa einem halben Dutzend an technische Grenzen stößt.

Die Forscher waren nicht nur in der Lage, mehr Immunzelltypen gleichzeitig zu kategorisieren als je zuvor, sondern gleichzeitig in diese Zellen zu blicken und zu erfahren, wie sich verschiedene interne Prozesse von einem Zelltyp zum nächsten unterscheiden.

"Wir können nicht nur sagen, um welche Art von Zelle es sich handelt, sondern im Wesentlichen, was sie denkt, was sie getan hat und was sie bald tun oder werden könnte", sagte Garry Nolan, PhD, Professor für Mikrobiologie und Immunologie und der leitende Autor der Studie, die den Fortschritt detailliert beschreibt und am 6. Mai in Science veröffentlicht wird.

Mit diesem neuen Ansatz konnten die Wissenschaftler außerdem die unerwarteten Wirkungen eines kürzlich zur Behandlung bestimmter Leukämien zugelassenen Medikaments - Dasatinib - auf biochemische Aktivitäten zeigen, die in verschiedenen Zelltypen stattfinden, und bieten eine mögliche Erklärung für einige davon Nebenwirkungen von Dasatinib sowie Hinweise auf potenzielle neue Anwendungen für das Medikament.

In der Studie überwachten Nolan und seine Kollegen gleichzeitig 34 verschiedene Substanzen, die innerhalb und auf der Oberfläche verschiedener Zelltypen gefunden wurden, die im menschlichen Knochenmark produziert werden, dem Ort, an dem alle Immun- und Blutzellen sowie Blutkrankheiten wie z Leukämie, Ursprung.

Durch die gleichzeitige Messung einer großen Anzahl von Zellmerkmalen mit der neuen Technologie - Massenzytometrie genannt - konnte das Team subtile Übergänge zwischen Zellzuständen im Wesentlichen in einer hochauflösenden Momentaufnahme des gesamten blutbildenden Systems erfassen. er sagte. Wissenschaftler stellen sich normalerweise vor, dass Blut- und Immunzellen in einer Reihe diskreter Schritte differenzieren. Die Autoren zeigten jedoch, dass die Übergänge von einem Zellzustand in einen anderen durch allmählich wechselnde Niveaus von Zelloberflächenmarkern und unterschiedliche Mengen und Aktivierungszustände mehrerer interzellulärer Moleküle gekennzeichnet sind.

Die Massenzytometrie baut auf einer etablierten Technologie auf, die als fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder FACS bekannt ist und weltweit weit verbreitet ist. FACS wurde im Labor von Leonard Herzenberg, PhD, emeritierter Professor für Genetik, entwickelt, unter dessen Leitung Nolan in den 1980er Jahren promovierte.

Sowohl FACS als auch Massenzytometrie verwenden Antikörper, um bestimmte Oberflächenmerkmale auf Zellen spezifisch zu markieren.

Bei herkömmlichen FACS werden Antikörper entwickelt, um verschiedene Zellmerkmale zu markieren. Dann werden die Antikörper an unterschiedlich fluoreszierende Farbstoffe gebunden, die diese Antikörper je nach Zellmerkmal, auf das sie abzielen, farblich codieren. Nach dem Baden in diesen Antikörper-Farbstoffpräparaten werden die Zellen im Gänsemarsch durch ein Röhrchen geleitet und mit Laserpulsen stimuliert, die die Farbstoffmoleküle zu Lichtblitzen veranlassen. Unterschiedliche Wellenlängen des von den Farbstoffen emittierten Lichts entsprechen den zellulären Merkmalen, die die Farbstoffe markiert haben. Obwohl die FACS-Technologie über 30 Jahre alt ist, ist sie eine tragende Säule von Immunstudien sowie der Krebs- und Impfstoffforschung.

Aber die Forscher sind bestrebt, immer mehr Informationen aus jeder untersuchten Zelle herauszuholen. Dazu müssen immer mehr Zellmerkmale auf einmal untersucht werden, und der Regenbogen hat nur eine begrenzte Anzahl von Farben. Die Fähigkeit von FACS, zwischen mehr als einem halben Dutzend Farbstoffen zu unterscheiden, wird durch die überlappenden Fluoreszenzmuster dieser Farbstoffe eingeschränkt.

Vor drei Jahren wurde Nolan von Scott Tanner angesprochen, einem Physikochemiker, der jetzt an der Universität von Toronto arbeitet.

"Er hat mich bei einem Meeting angestarrt", sagte Nolan lachend. „Ich habe versucht, von ihm wegzukommen, aber nachdem er ein paar Minuten geredet hatte, wurde mir klar, dass ich besser darauf achten sollte. Er hatte eindeutig etwas, das, wenn es wahr war, ein revolutionäres Potenzial hatte."

Tanners Team passte ein vorhandenes Instrument für biologische Zwecke an, das normalerweise zur Messung präziser Geh alte an hinzugefügten Seltenerdverunreinigungen in Halbleitern und für geologische Zwecke verwendet wird. Das neue Instrument namens Massenzytometer versprach, die Anzahl der molekularen Merkmale, die gleichzeitig in jeder Zelle gemessen werden könnten, mehr als zu verdoppeln. Nolan, der erkannte, dass ein solches Instrument verwendet werden könnte, um viel mehr über das Immunsystem und Krebsstammzellen zu erfahren, war bestrebt, das Fachwissen seiner Gruppe in seine Entwicklung einzubringen.Seitdem arbeitet das Stanford-Team eng mit den Entwicklern des neuen Instruments zusammen.

Anstelle von Farbstoffen verbindet die Massenzytometrie Seltenerdmetalle mit Antikörpern, die wiederum zelluläre Merkmale und Prozesse erkennen. „Die Seltenen Erden sind eine Reihe von 17 Elementen, meist am Ende des Periodensystems, über die niemand im Chemieunterricht etwas lernen wollte, mich eingeschlossen“, sagte Sean Bendall, PhD, ein Postdoktorand in Nolans Labor. Diese Elemente erweisen sich jedoch als besonders nützlich für biologische Anwendungen, sagte Bendall, die sich die Erstautorenschaft des Science-Papiers mit Erin Simonds teilte, einer Doktorandin in Nolans Labor.

"Sie sind in der Natur gar nicht so selten, aber normalerweise werden sie nie im Körper gefunden", sagte Bendall. „Wenn ich mir eine Probe Ihres Blutes ansehen und etwas Europium oder Ytterbium oder Neodym darin finden würde, würde ich sagen, dass Sie in großen Schwierigkeiten stecken.“Seltenerdelemente heben sich also von der Masse ab.

Außerdem können diese Elemente in bis zu 100 Varianten mit unterschiedlichen Atomgewichten unterteilt werden. Massenzytometrie kann diese Unterschiede leicht erkennen. "Wir brauchen relativ wenige Seltenerdatome pro Zelle, damit unser Instrument sie sehen kann", sagte Bendall.

Bei der Massenzytometrie werden Zellen einzeln durch ein Rohr geführt und in eine winzige Kammer gesprüht, in der sie auf etwa 13.000 Grad Fahrenheit erhitzt und in aufeinanderfolgende Wolken aus Atomkernen und losen Elektronen verdampft werden. Als nächstes wird der Inh alt jeder Wolke, die einmal eine Zelle war, im Wesentlichen mit gleicher Kraft gegen eine Wand geschleudert. Die leichtesten Atome treffen zuerst ein, dann die zweitleichtesten und so weiter. Ein Detektor zählt die auftreffenden Atome, daraus kann das Instrument ihre Masse bestimmen. Die Masse gibt an, wie viele Kopien jedes metallmarkierten Antikörpers an die Zelle geklebt wurden und wie viele Kopien jedes molekularen Merkmals überhaupt auf oder in der Zelle vorhanden waren.

In der Science-Studie verwendeten Nolan und seine Kollegen das Instrument, um gleichzeitig 13 verschiedene molekulare Merkmale auf den Oberflächen von Zellen in Proben zu überwachen, die dem Knochenmark von zwei gesunden Menschen entnommen wurden, und klassifizierten die Zellen in zahlreiche verschiedene Kategorien. Die Forscher überwachten gleichzeitig die Aktivierungszustände von 18 verschiedenen intrazellulären Proteinzielen. Proteinaktivierungsniveaus geben wichtige Hinweise auf bestimmte zelluläre Entscheidungen, die getroffen wurden oder getroffen werden können, z. B. ob eine Zelle kurz vor der Teilung steht.

"Als Auftakt zur Untersuchung leukämischer Knochenmarkproben wollten wir zunächst die Zellen in normalem Knochenmark charakterisieren, um zu sehen, wie sich ihr Verh alten während der Reifung ändert", sagte Simonds.

Die Nolan-Gruppe störte Zellen, indem sie sie verschiedenen Substanzen aussetzten, darunter Signalmoleküle, die manchmal in unserem eigenen Blut zirkulieren, sowie Fremdmaterialien wie Fragmente von Bakterienzellwänden, von denen bekannt ist, dass sie Immunantworten hervorrufen."Im Wesentlichen", sagte Nolan, "befragen oder befragen wir die Zellen und zwingen sie, ihre inneren Denkprozesse preiszugeben." Einige dieser Stimulationstests wurden in Gegenwart von Dasatinib durchgeführt, einem Medikament zur Behandlung von chronischer myeloischer Leukämie und bestimmten Fällen von akuter lymphoblastischer Leukämie. Dasatinib befindet sich in klinischen Studien für mehrere andere Indikationen, einschließlich einiger solider Krebsarten.

Als die Nolan-Gruppe eine Chemikalie, Pervanadat, verwendete, um ein universelles Pro-Zell-Überlebensverh alten „auszubremsen“, blockierte Dasatinib die Wirkung in jedem Zelltyp mit Ausnahme eines, der als dendritische Zellen bezeichneten Immunwächter. Simonds sagte, dieser neue Befund zeige die Fähigkeit der Massenzytometrie, winzige Unterschiede im Zellverh alten aufzuspüren, die helfen könnten, die Nebenwirkungen von Medikamenten zu erklären, sowie potenzielle neue Anwendungen für bestehende Medikamente aufzuzeigen.

Je mehr Messungen Ihr Schneider macht, desto besser die Passform. Dasselbe gilt für die Zellbiologie."Unser gesamtes Labor hat bereits von fluoreszenzbasierten Messungen von Zellmerkmalen auf diese neue MS-basierte Methode umgestellt, weil wir ein viel vollständigeres Bild erh alten", sagte Bendall.

Nolan hat berichtet, dass er Anteile an der Firma besitzt, die Tanner gegründet hat, um das neue System zu entwickeln und zu vermarkten.

Die Studie wurde vom National Heart, Lung and Blood Institute, dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases, dem National Cancer Institute und der Leukemia & Lymphoma Society gesponsert. Andere Stanford-Co-Autoren sind der leitende Forschungswissenschaftler Peter Krutzik, PhD; Postdoktorandin Karen Sachs, PhD; Datenanalytikerin Rachel Finck; wissenschaftliche Mitarbeiterin Angelica Trejo; Doktorand Robert Bruggner; außerordentliche Professorin für Radiologie Sylvia Plevritis, PhD; und ehemaliger Postdoktorand Peng Qiu, PhD, jetzt außerordentlicher Professor am MD Anderson Cancer Center der Universität von Texas.

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