Forscher erweitern das Verständnis des Enzyms, das die DNA reguliert

Forscher erweitern das Verständnis des Enzyms, das die DNA reguliert
Forscher erweitern das Verständnis des Enzyms, das die DNA reguliert
Anonim

Dank einer Einzelmolekül-Bildgebungstechnik, die von einem Professor der University of Illinois entwickelt wurde, haben Forscher die Mechanismen eines wichtigen DNA-regulierenden Enzyms aufgedeckt.

Helicase-Enzyme sind am besten dafür bekannt, DNA für die Replikation zu "entpacken", haben aber viele andere Funktionen für die DNA-Reparatur und -Erh altung. Das Team aus Illinois konzentrierte sich auf eine bestimmte bakterielle Helikase namens PcrA, die an der Verhinderung unerwünschter Rekombination beteiligt ist.

Eine DNA-Doppelhelix besteht aus zwei Strängen, die umeinander verdreht sind.Wenn ein Strang beschädigt wird oder bricht, wird der umgebende Bereich degradiert, wodurch ein einzelsträngiger Bereich zurückbleibt. Spezialisierte Proteine ​​starten dann den Prozess der Rekombination – der Wiederaufbau des zweiten Strangs unter Verwendung der intakten DNA als Vorlage.

"Rekombination ist für die DNA-Reparatur unerlässlich, aber wenn sie Amok läuft, verursacht sie Probleme", sagte Physikprofessor Taekjip Ha von der U. of I.. "Diese Helikase kontrolliert die Rekombination, indem sie Rekombinationsproteine ​​aus der DNA entfernt."

Mit einer Technik namens Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) konnten Ha und sein Team einen der Mechanismen identifizieren, die PcrA zur Regulierung der Rekombination verwendet. Das System verwendet zwei Farbstoffe, deren relative Intensität sich in Abhängigkeit von ihrer Nähe zueinander ändert. Die Forscher befestigten die beiden Farbstoffe an den gegenüberliegenden Enden des einzelsträngigen DNA-Schwanzes.

Helikasen sind Motorproteine, eine Klasse von Enzymen, die chemische Energie verwenden, um sich entlang eines DNA-Moleküls wie ein Zug auf einem Gleis zu bewegen.Aber mit FRET beobachteten die Forscher, wie sich die beiden Farbstoffe allmählich näher aneinander bewegten und dann wiederholt auseinander flogen. Anstatt sich entlang des einzelsträngigen Schwanzes zu bewegen, bindet PcrA an der Bruchstelle, wo sich die doppel- und einzelsträngigen Regionen treffen. Dann verwendet es seine motorische Funktion, um den Schwanz "einzurollen", wie ein Fischer, der ein Seil einzieht.

"Durch die Kombination der strukturspezifischen Bindung des Enzyms an die DNA und der motorischen Funktion kann das Enzym die DNA einspulen und dabei Rekombinationsproteine ​​​​anstoßen", sagte Ha, der auch ein Howard Hughes ist Ermittler des medizinischen Instituts.

Wenn PcrA das Ende seines DNA-Seils erreicht, gibt es es frei und beginnt den Aufrollprozess erneut, wobei alle zusätzlichen problematischen Proteine ​​entfernt werden, die sich beim Aufrollen an die beschädigte DNA gebunden haben.

Durch die Verwendung von FRET, einer von Ha entwickelten Technik, konnte das Team auch eine weitere Frage zu PcrA beantworten: Wie konsistent ist seine motorische Funktion? Forscher sind sich einig, dass PcrA im Durchschnitt eine DNA-Einheit, Basenpaar genannt, für jede verbrauchte Einheit zellulärer Energie, ATP genannt, bewegt.Da Forscher das Enzym jedoch traditionell in relativ großen Proben untersuchen, haben breite Datenverteilungen zu widersprüchlichen Ansichten darüber geführt, ob sich die Helikase in gleichmäßigen Schritten oder in Schritten unterschiedlicher Länge bewegt – sogar bis zu sechs Basenpaaren pro ATP.

Da FRET eine Einzelmolekültechnik ist, konnten die Forscher die Funktion eines einzelnen Enzyms Schritt für Schritt dokumentieren und fanden heraus, dass sich PcrA tatsächlich in einheitlichen Schritten von einem Basenpaar pro ATP bewegt.

Als nächstes plant das Team, eine Reaktionsumgebung zu schaffen, die der in vivo ähnlicher ist, indem es drei- und vierfarbige FRET-Farbstoffe verwendet, um die Aktivitäten mehrerer Proteine ​​gleichzeitig zu messen. Sie arbeiten auch daran zu verstehen, warum sich die Helicase nur in eine Richtung bewegt.

"Dies ist eine ideale Kombination aus einer neuen Technologie und einem interessanten biologischen Problem", sagte Ha.

Das Team veröffentlichte seine Ergebnisse in der Ausgabe des Journals Cell vom 20. August. Zu den Teammitgliedern gehörten U.der I. Doktoranden Jeehae Park und Kyung Suk Lee; Bioingenieur-Professorin Sua Myong; Anita Niedziela-Majka und Timothy Lohman von der Washington University School of Medicine in St. Louis; und Jin Yu von der University of California in Berkeley. Die National Institutes of He alth und die National Science Foundation haben diese Arbeit unterstützt.

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