Neuer, empfindlicherer Nanotechnologie-Test für chemische DNA-Modifikationen entwickelt

Neuer, empfindlicherer Nanotechnologie-Test für chemische DNA-Modifikationen entwickelt
Neuer, empfindlicherer Nanotechnologie-Test für chemische DNA-Modifikationen entwickelt
Anonim

Forscher der Johns Hopkins University School of Medicine in B altimore haben einen neuartigen Test entwickelt, um nach chemischen Modifikationen der DNA zu suchen, die als Methylierung bekannt sind. Die Technologie könnte potenziell sowohl für die Krebsfrühdiagnose als auch für die Beurteilung des Ansprechens von Patienten auf Krebstherapien eingesetzt werden.

Während der Methylierung können gesunde Gene an- oder abgesch altet werden, die möglicherweise Krebs verursachen, ohne dass die zugrunde liegende DNA-Sequenz verändert wird. Die aktuellen Methoden für das Methylierungs-Screening haben erhebliche Nachteile, erklärt der Hauptautor der Studie Vasudev Bailey, ein Ph.D. Kandidat bei Hopkins.

Methylierungsspezifische PCR, die bestimmte DNA-Sequenzen innerhalb weniger Stunden millionenfach kopiert, ist möglicherweise nicht empfindlich genug, um kleine Mengen an Methylierung nachzuweisen, und Echtzeit-PCR, mit der Wissenschaftler einen Anstieg der DNA-Menge erkennen können Da es kopiert wird, muss es mehrmals ausgeführt werden und kann teuer werden, sagt er.

Der von Hopkins entwickelte Test macht die PCR-Technologie empfindlicher und effizienter, sagte Bailey. Die Arbeit wurde auf der dritten International Conference on Molecular Diagnostics in Cancer Therapeutic Development der American Association for Cancer Research vorgestellt, die vom 22. bis 25. September 2008 in Philadelphia stattfand.

"Die Auswirkungen des Nachweises von DNA-Methylierung sind tiefgreifend, da gezeigt wurde, dass eine größere Anzahl von Tumorsuppressorgenen durch DNA-Methylierung inaktiviert werden als durch Mutationen", sagte Bailey. „Unsere Methode des Methylierungs-Screenings bietet ein einfaches, kostengünstiges und wertvolles Instrument für die Früherkennung von Krebs, die Überwachung des Tumorverh altens und die Messung des Ansprechens von Tumoren auf gezielte Krebstherapien."

Um die Technik zu testen, behandelten Bailey und Kollegen DNA-Segmente mit der chemischen Verbindung Natriumbisulfat. Dadurch wurden unmethylierte Cytosine (eine der Basen der DNA) automatisch in Uracile (eine der Basen der Ribonukleinsäure oder RNA, die mit der DNA zusammenarbeitet, um Proteine ​​zu synthetisieren) umgewandelt, während die methylierten Cytosine unberührt blieben.

Dann nutzten die Wissenschaftler eine PCR mit markierten Primern, um diese DNA-Abschnitte zu kopieren und mit dem Vitamin Biotin zu markieren. Als nächstes fügten sie den Proben, die mit dem Protein Streptavidin beschichtet waren, Quantenpunkte hinzu (etwa ein Milliardstel Meter große Moleküle mit elektrischen Eigenschaften). Wie eine magnetische Kraft wurden die biotinbeschichteten methylierten DNA-Segmente von der Streptavidin-Beschichtung der Quantenpunkte angezogen, wodurch die DNA-Methylierung hervorgehoben und quantifiziert wurde.

Der neue Test war empfindlich genug, um nur 15 Picogramm methylierte DNA in Gegenwart eines 10.000-fachen Überschusses an unmethylierten kodierenden Sequenzen oder das Äquivalent von fünf Zellen nachzuweisen.Darüber hinaus demonstrierten sie die Nachweisfähigkeit in nur acht PCR-Zyklen. In Zusammenarbeit mit seinem Kollegen Yi Zhang, ebenfalls Doktorand an der Johns Hopkins School of Medicine, konnten sie Ergebnisse mit sehr kleinen Proben sehen (durchschnittlich 800 Milliardstel Liter pro Reaktion und mehr als fünfzig Mal weniger Probe und Reagenz als derzeit verwendet) unter Verwendung eines neuartigen Lab-on-Chip-Systems. Dieses System ermöglicht eine minimale Übergabe von Proben durch den Forscher, während eine gleichzeitige Verarbeitung und Analyse mehrerer Proben möglich ist. Forscher haben ein vorläufiges Patent auf den Test.

In zusätzlichen Experimenten nutzten die Forscher die Technologie, um die Methylierung des Gens ASC/TMS1, das den programmierten Zelltod fördert, in geringen DNA-Konzentrationen aus menschlichem Sputum genau nachzuweisen. Dies wurde mit weniger Schritten und weniger PCR-Zyklen erreicht. Die Wissenschaftler verwendeten den Test auch, um das Ausmaß der Methylierungsumkehr in Knochenmarksflüssigkeitsproben zu quantifizieren, die Patienten mit myelodysplastischem Syndrom – einer Erkrankung, bei der Knochenmarkszellen nicht normal funktionieren – vor und nach der Behandlung mit Medikamenten entnommen wurden.

Bailey sagte, der neue Test ermögliche es Wissenschaftlern, die Methylierung mehrerer Gene gleichzeitig nachzuweisen oder methylierte und unmethylierte DNA gleichzeitig zu betrachten. Es zeigt auch den Prozentsatz der Methylierung zu einem bestimmten Zeitpunkt an.

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